Laboratorio di Tossicologia Ambientale ed Occupazionale
Il laboratorio di Tossicologia Ambientale e Occupazionale nasce circa sette anni fa dalla attiva collaborazione tra la Sezione di Istologia ed Embriologia e la Sezione di Medicina del Lavoro del Dipartimento di Biomedicina e Prevenzione. Il laboratorio offre una serie di test in vitro, validati dallo European Committee for the Validation of Alternative Methods (ECVAM), per la determinazione del potenziale tossico di sostanze di diversa natura e di materiale particolato, incluse le nanoparticelle ingegnerizzate. L’intenso lavoro di ricerca che caratterizza il laboratorio è indirizzato allo sviluppo e al perfezionamento dei test tossicologici attualmente disponibili. Per questo, il nostro personale altamente qualificato è dedicato allo sviluppo di ulteriori test per un “high-throughput screening” di sostanze potenzialmente embriotossiche.
Il vantaggio dei test di tossicologia dello sviluppo risiede nella loro elevata sensibilità. Le cellule embrionali sono infatti più sensibili a sostanze xenobiotiche rispetto a cellule adulte, permettendo quindi una più sensibile valutazione del potenziale tossico di una specifica sostanza rispetto a test su cellule differenziate.
Il laboratorio dispone di tutte le strumentazioni necessarie e si avvale di personale altamente specializzato con anni di esperienza in questo ambito. Le competenze fino ad oggi acquisite hanno permesso la partecipazione del laboratorio a diversi progetti europei del settimo programma quadro (EU-FP7), incluso il progetto NANoREG (A common European approach to the regulatory testing of Manufactured Nanomaterials), che ha avuto lo scopo di fornire informazioni sull’impatto biologico dei nanomateriali a fini regolatori.
L’offerta dei servizi del Laboratorio di Tossicologia Ambientale e Occupazionale comprende:
Embryonic Stem Cell Test
L’Embryonic stem cell test (EST) è un test validato dall’ECVAM e normalmente utilizzato in campo farmaceutico e industriale per predire il potenziale embriotossico di sostanza chimiche. Sebbene sia stato recentemente riconosciuto che da solo non può essere utilizzato a fini regolatori, questo test permette lo screening preliminare di un ampio numero di sostanze, permettendo l’identificazione di quelle che necessitano di un ulteriore approfondimento con altri test in vitro ed in vivo. L’EST si basa sulla determinazione dei più importanti parametri embriotossici: l'inibizione del differenziamento cellulare si combina con lo studio della differente sensibilità tra i tessuti embrionali e adulti al danno citotossico . In particolare, l’EST utilizza due linee cellulari , le cellule staminali embrionali murine (mES a rappresentare tessuto embrionale ) e le cellule 3T3 (fibroblasti di topo a rappresentare il tessuto adulto ), e valuta tre endpoint: l'inibizione del differenziamento delle mES in corpi embrioidi (strutture che grossolanamente ricapitolano lo sviluppo embrionale in vitro), e l'inibizione della proliferazione delle mES e delle cellule 3T3. I valori numerici ottenuti da questi esperimenti vengono successivamente combinati in un algoritmo che determina il grado di embriotossicità (forte, debole e non embriotossico ). Risultati completi circa il potenziale embriotossico di una particolare sostanza possono essere ottenuti in circa 15-30 giorni.
L’EST è stato recentemente messo a punto e impiegato con successo per la valutazione dell’embriotossicità di particelle con diametro inferiori a 0,1 micron (Pietroiusti et al., 2011; Campagnolo et al., 2013; Farcal et al., 2015;).
Embryonic Stem Cell Test modificato
E’ stato riconosciuto che nel corso del differenziamento in vitro delle cellule embrionali staminali (ES) in corpi embrioidi (EB), vengono espressi geni in maniera regolata, nello spazio e nel tempo, ricapitolando quanto accade nell’embrione in vivo (Leahy et al., 1999). L’EST modificato si basa sulla analisi della possibile modificazione temporale nella espressione di marcatori del differenziamento, causata da una specifica sostanza.
Il test consta di una piattaforma di screening mediante Multiplex Real-Time PCR che permette di valutare in EB esposti o meno a sostanze potenzialmente tossiche l’espressione differenziale di un pannello selezionato di geni, che vengono espressi in maniera temporalmente regolata nel corso del differenziamento. L’analisi comprende lo studio dell’espressione di geni che vengono comunemente utilizzati come marcatori precoci della specificazione dei tre foglietti embrionali e di geni che identificano il differenziamento delle varie linee cellulari. Come geni marcatori dei tre foglietti embrionali vengono analizzati oct-3 e Fgf-5 (marcatori di ectoderma; Haub and Goldfarb, 1991), GATA-4 (marcatore di endoderma primitivo e di tessuti di derivazione endodermica; Arceci et al., 1993), nodal (che nell’embrione marca la stria primitiva; Zhou et al., 1993), e Brachyury T (marcatore precoce di mesoderma; Herrmann, 1991). Come marcatori delle varie linee verranno analizzati flk-1, quale marcatore delle cellule endoteliali e dei loro precursori (Yamaguchi et al., 1993), Nkx-2.5, marcatore del mesoderma cardiogenico (Lints et al., 1993), EKLF, marcatore della linea eritroide (Southwood et al., 1996), e Msx3, che marca il tubo neurale (Wang et al., 1996). Il confronto dell’analisi di espressione genica nel corso del differenziamento degli EB (dal giorno 3 al giorno 15), in presenza o meno di una sostanza in studio permette di capire se questa è in grado di perturbare il normale sviluppo embrionale.
Analisi dell’Embriotossicità mediante Embryotoxicity Assay (ETA)
Questo test, basato sulla coltura in vitro di embrioni pre-impianto (blastocisti) di topo, valuta la capacità di una sostanza di interferire con il normale processo di uscita delle blastocisti dalla zona pellucida (sgusciamento), la successiva adesione alla piastra di coltura e l’apertura (outgrowth). Il test è stato originariamente sviluppato per valutare la presenza di embrio-tossine nel siero di pazienti affette da aborti ricorrenti, ed è stato successivamente impiegato in un più vasto ambito tossicologico. Le blastocisti vengono raccolte, dopo stimolazione ormonale, da animali al girono 3.5 di gravidanza, vengono casualmente divise in gruppi di almeno 20 e messe in coltura in presenza di delle sostanze in esame. Le colture sono controllate e fotografate ad intervalli regolari per le successive 72 ore. Nel nostro laboratorio questo test è stato applicato allo screening del potenziale embriotossico delle nanoparticelle ingegnerizzate, in combinazione con l’EST.
Test dell’Embrione di ratto in coltura
Il test dell’embrione post-impianto di ratto è stato sviluppato per identificare sostanze che inducono malformazioni e conseguente embriotossicità; data la sua complessità, questo test non può essere impiegato come un metodo di screening su larga scala, ma piuttosto come un approccio secondario per un limitato numero di sostanze identificate come potenzialmente tossiche mediante altri test, per stabilirne la priorità per studi in vivo. Il test si basa sull’uso di embrioni di ratto allo stadio di 1-5 somiti, che vengono mantenuti in colture rotanti per 48 ore, periodo durante il quale avvengono i principali eventi dell’organogenesi (e.g., chiusura del tubo neurale, sviluppo dell’occhio e dell’orecchio). Al termine della coltura il confronto tra controlli ed embrioni coltivati in presenza delle sostanze in esame permette di evidenziare eventuali alterazioni dello sviluppo.
Il vantaggio dei test di tossicologia dello sviluppo risiede nella loro elevata sensibilità. Le cellule embrionali sono infatti più sensibili a sostanze xenobiotiche rispetto a cellule adulte, permettendo quindi una più sensibile valutazione del potenziale tossico di una specifica sostanza rispetto a test su cellule differenziate.
Il laboratorio dispone di tutte le strumentazioni necessarie e si avvale di personale altamente specializzato con anni di esperienza in questo ambito. Le competenze fino ad oggi acquisite hanno permesso la partecipazione del laboratorio a diversi progetti europei del settimo programma quadro (EU-FP7), incluso il progetto NANoREG (A common European approach to the regulatory testing of Manufactured Nanomaterials), che ha avuto lo scopo di fornire informazioni sull’impatto biologico dei nanomateriali a fini regolatori.
L’offerta dei servizi del Laboratorio di Tossicologia Ambientale e Occupazionale comprende:
Embryonic Stem Cell Test
L’Embryonic stem cell test (EST) è un test validato dall’ECVAM e normalmente utilizzato in campo farmaceutico e industriale per predire il potenziale embriotossico di sostanza chimiche. Sebbene sia stato recentemente riconosciuto che da solo non può essere utilizzato a fini regolatori, questo test permette lo screening preliminare di un ampio numero di sostanze, permettendo l’identificazione di quelle che necessitano di un ulteriore approfondimento con altri test in vitro ed in vivo. L’EST si basa sulla determinazione dei più importanti parametri embriotossici: l'inibizione del differenziamento cellulare si combina con lo studio della differente sensibilità tra i tessuti embrionali e adulti al danno citotossico . In particolare, l’EST utilizza due linee cellulari , le cellule staminali embrionali murine (mES a rappresentare tessuto embrionale ) e le cellule 3T3 (fibroblasti di topo a rappresentare il tessuto adulto ), e valuta tre endpoint: l'inibizione del differenziamento delle mES in corpi embrioidi (strutture che grossolanamente ricapitolano lo sviluppo embrionale in vitro), e l'inibizione della proliferazione delle mES e delle cellule 3T3. I valori numerici ottenuti da questi esperimenti vengono successivamente combinati in un algoritmo che determina il grado di embriotossicità (forte, debole e non embriotossico ). Risultati completi circa il potenziale embriotossico di una particolare sostanza possono essere ottenuti in circa 15-30 giorni.
L’EST è stato recentemente messo a punto e impiegato con successo per la valutazione dell’embriotossicità di particelle con diametro inferiori a 0,1 micron (Pietroiusti et al., 2011; Campagnolo et al., 2013; Farcal et al., 2015;).
Embryonic Stem Cell Test modificato
E’ stato riconosciuto che nel corso del differenziamento in vitro delle cellule embrionali staminali (ES) in corpi embrioidi (EB), vengono espressi geni in maniera regolata, nello spazio e nel tempo, ricapitolando quanto accade nell’embrione in vivo (Leahy et al., 1999). L’EST modificato si basa sulla analisi della possibile modificazione temporale nella espressione di marcatori del differenziamento, causata da una specifica sostanza.
Il test consta di una piattaforma di screening mediante Multiplex Real-Time PCR che permette di valutare in EB esposti o meno a sostanze potenzialmente tossiche l’espressione differenziale di un pannello selezionato di geni, che vengono espressi in maniera temporalmente regolata nel corso del differenziamento. L’analisi comprende lo studio dell’espressione di geni che vengono comunemente utilizzati come marcatori precoci della specificazione dei tre foglietti embrionali e di geni che identificano il differenziamento delle varie linee cellulari. Come geni marcatori dei tre foglietti embrionali vengono analizzati oct-3 e Fgf-5 (marcatori di ectoderma; Haub and Goldfarb, 1991), GATA-4 (marcatore di endoderma primitivo e di tessuti di derivazione endodermica; Arceci et al., 1993), nodal (che nell’embrione marca la stria primitiva; Zhou et al., 1993), e Brachyury T (marcatore precoce di mesoderma; Herrmann, 1991). Come marcatori delle varie linee verranno analizzati flk-1, quale marcatore delle cellule endoteliali e dei loro precursori (Yamaguchi et al., 1993), Nkx-2.5, marcatore del mesoderma cardiogenico (Lints et al., 1993), EKLF, marcatore della linea eritroide (Southwood et al., 1996), e Msx3, che marca il tubo neurale (Wang et al., 1996). Il confronto dell’analisi di espressione genica nel corso del differenziamento degli EB (dal giorno 3 al giorno 15), in presenza o meno di una sostanza in studio permette di capire se questa è in grado di perturbare il normale sviluppo embrionale.
Analisi dell’Embriotossicità mediante Embryotoxicity Assay (ETA)
Questo test, basato sulla coltura in vitro di embrioni pre-impianto (blastocisti) di topo, valuta la capacità di una sostanza di interferire con il normale processo di uscita delle blastocisti dalla zona pellucida (sgusciamento), la successiva adesione alla piastra di coltura e l’apertura (outgrowth). Il test è stato originariamente sviluppato per valutare la presenza di embrio-tossine nel siero di pazienti affette da aborti ricorrenti, ed è stato successivamente impiegato in un più vasto ambito tossicologico. Le blastocisti vengono raccolte, dopo stimolazione ormonale, da animali al girono 3.5 di gravidanza, vengono casualmente divise in gruppi di almeno 20 e messe in coltura in presenza di delle sostanze in esame. Le colture sono controllate e fotografate ad intervalli regolari per le successive 72 ore. Nel nostro laboratorio questo test è stato applicato allo screening del potenziale embriotossico delle nanoparticelle ingegnerizzate, in combinazione con l’EST.
Test dell’Embrione di ratto in coltura
Il test dell’embrione post-impianto di ratto è stato sviluppato per identificare sostanze che inducono malformazioni e conseguente embriotossicità; data la sua complessità, questo test non può essere impiegato come un metodo di screening su larga scala, ma piuttosto come un approccio secondario per un limitato numero di sostanze identificate come potenzialmente tossiche mediante altri test, per stabilirne la priorità per studi in vivo. Il test si basa sull’uso di embrioni di ratto allo stadio di 1-5 somiti, che vengono mantenuti in colture rotanti per 48 ore, periodo durante il quale avvengono i principali eventi dell’organogenesi (e.g., chiusura del tubo neurale, sviluppo dell’occhio e dell’orecchio). Al termine della coltura il confronto tra controlli ed embrioni coltivati in presenza delle sostanze in esame permette di evidenziare eventuali alterazioni dello sviluppo.
The Laboratory of Environmental and Occupational Toxicology was created about seven years ago by the active collaboration between the Histology and Embryology Section and the Occupational Medicine Section of the Department of Biomedicine and Prevention. The laboratory offers a series of in vitro tests, validated by the European Committee for the Validation of Alternative Methods (ECVAM), for the determination of the toxic potential of different substances and particulate matter, including engineered nanoparticles. The intensive research work that characterizes the lab is aimed at the development and upgrading of toxicological tests currently available. That is why our highly qualified staff is dedicated to the development of further tests for “high-throughput screening” of potentially embryotoxic substances.
The advantage of developmental toxicology tests lies in their high sensitivity. Embryonic cells are, in fact, more sensitive to xenobiotic substances than adult cells, thus allowing a more precise assessment of the toxic potential of a specific substance than differentiated cell testing.
The laboratory has all the necessary equipment and employs highly specialized staff, with years of experience in this field. The skills acquired so far have allowed the laboratory to participate in various European projects of the Seventh Framework Program (EU-FP7), including the NANoREG (A Common European Approach to the Regulatory Testing of Manufactured Nanomaterials) project, which was aimed at providing information regarding the biological impact of nanomaterials for regulatory purposes.
The services offered by the Laboratory of Environmental and Occupational Toxicology include:
Embryonic Stem Cell Test
The Embryonic Stem Cell Test (EST) is an ECVAM validated test and is normally used in the pharmaceutical and industrial field to predict the embryotoxic potential of chemical substances. Although it was recently recognized that this test alone cannot be used for regulatory purposes, it allows for the preliminary screening of a large number of substances, allowing the identification of those that require further in-depth study with in vitro and in vivo tests. The EST is based on the determination of the most important embryotoxic parameters: the inhibition of cell differentiation is combined with the study of the different sensitivity between embryonic and adult tissues to cytotoxic damage. In particular, EST uses two cell lines, mouse embryonic stem cells (mES to represent embryonic tissue) and 3T3 cells (mouse fibroblasts to represent adult tissue), and evaluates three endpoints: inhibition of mES differentiation in embryoid bodies (in vitro structures that roughly ricapitulate the embryonic development), and inhibition of the proliferation of mES and 3T3 cells. The numerical values obtained from these experiments are then combined into an algorithm that determines the degree of embryotoxicity (strong, weak, and non-embryotoxic). Complete results about the embryotoxic potential of a particular substance can be obtained in about 15 to 30 days.
The EST was recently developed and successfully used for the evaluation of the embryotoxicity of particles with a diameter shorter than 0.1 micron (Pietroiusti et al., 2011; Campagnolo et al., 2013; Farcal et al., 2015).
Modified Embryonic Stem Cell Test
It has been recognized that during the in vitro differentiation of embryonic stem cells (ES) into embryoid bodies (EB), genes are expressed in a controlled manner in space and time, reproducing what happens in the embryo in vivo (Leahy et al., 1999). The modified EST is based on the analysis of the possible temporal modification in the expression of markers of differentiation, caused by a specific substance.
The test consists of a screening platform using Multiplex Real-Time PCR that allows the evaluation in EBs, either exposed or not to potentially toxic substances, of the differential expression of a selected genes panel, that are expressed in a time-controlled manner during the differentiation. The analysis includes the study of the expression of genes commonly used as early markers for the specification of the three germ layers and of genes identifying the differentiation of the various cell lines. As marker genes of the three germ layers, oct-3 and Fgf-5 (ectodermic markers; Haub and Goldfarb, 1991), GATA-4 (primer endoderm marker and endodermic tissues markers; Arceci et al., 1993), nodal (which, in the embryo, marks the primitive streak; Zhou et al., 1993), and Brachyury T (early mesoderm marker; Herrmann, 1991) are analyzed. As markers of the various lines, flk-1, as markers of endothelial cells and their precursors (Yamaguchi et al., 1993), Nkx-2.5, cardiogenic mesoderm marker (Lints et al., 1993), EKLF, erythroid line marker (Southwood et al., 1996), and Msx3, which marks the neural tube (Wang et al., 1996) will be analyzed. Comparison of gene expression analysis during the EBs differentiation (from day 3 to day 15) in the study, either in presence or not of a substance, allows to understand whether this can disrupt normal embryonic development.
Examination of Embryotoxicity by Embryotoxicity Assay (ETA)
This test, based on the in vitro culture of pre-implant embryos (blastocysts) of the mouse, evaluates the ability of a substance to interfere with the normal blastocyst release process from the pellucid region (shedding), the subsequent adhesion to the culture plate and the outgrowth. The test was originally developed to evaluate the presence of embryotoxins in the serum of patients affected by recurrent miscarriages, and was subsequently used in a wider toxicological range. Blastocysts are harvested, after hormonal stimulation, from animals at 3.5 days into the pregnancy, are randomly divided into groups of at least 20 and cultured in the presence of the substances which are being studied. The cultures are checked and photographed at regular intervals for the next 72 hours. In our laboratory, this test has been applied to the screening of embryotoxic potential of engineered nanoparticles, in combination with EST.
Rat embryo culture test
The post-implant rat embryo test was developed to identify substances inducing malformations and consequent embryotoxicity; Given its complexity, this test cannot be used as a large-scale screening method, but rather as a secondary approach to a limited number of substances identified as potentially toxic through other tests, to assess the priority for in vivo studies. The test is based on the use of rat embryos at a level of 1-5 somites, which are maintained in rotating cultures for 48 hours, during which the major organogenic events occur (e.g. neural tube closure, eye and ear development). At the end of the growth, the comparison between the controls and embryos cultivated in the presence of the substances being studied allows to point out any alterations in the development.
The advantage of developmental toxicology tests lies in their high sensitivity. Embryonic cells are, in fact, more sensitive to xenobiotic substances than adult cells, thus allowing a more precise assessment of the toxic potential of a specific substance than differentiated cell testing.
The laboratory has all the necessary equipment and employs highly specialized staff, with years of experience in this field. The skills acquired so far have allowed the laboratory to participate in various European projects of the Seventh Framework Program (EU-FP7), including the NANoREG (A Common European Approach to the Regulatory Testing of Manufactured Nanomaterials) project, which was aimed at providing information regarding the biological impact of nanomaterials for regulatory purposes.
The services offered by the Laboratory of Environmental and Occupational Toxicology include:
Embryonic Stem Cell Test
The Embryonic Stem Cell Test (EST) is an ECVAM validated test and is normally used in the pharmaceutical and industrial field to predict the embryotoxic potential of chemical substances. Although it was recently recognized that this test alone cannot be used for regulatory purposes, it allows for the preliminary screening of a large number of substances, allowing the identification of those that require further in-depth study with in vitro and in vivo tests. The EST is based on the determination of the most important embryotoxic parameters: the inhibition of cell differentiation is combined with the study of the different sensitivity between embryonic and adult tissues to cytotoxic damage. In particular, EST uses two cell lines, mouse embryonic stem cells (mES to represent embryonic tissue) and 3T3 cells (mouse fibroblasts to represent adult tissue), and evaluates three endpoints: inhibition of mES differentiation in embryoid bodies (in vitro structures that roughly ricapitulate the embryonic development), and inhibition of the proliferation of mES and 3T3 cells. The numerical values obtained from these experiments are then combined into an algorithm that determines the degree of embryotoxicity (strong, weak, and non-embryotoxic). Complete results about the embryotoxic potential of a particular substance can be obtained in about 15 to 30 days.
The EST was recently developed and successfully used for the evaluation of the embryotoxicity of particles with a diameter shorter than 0.1 micron (Pietroiusti et al., 2011; Campagnolo et al., 2013; Farcal et al., 2015).
Modified Embryonic Stem Cell Test
It has been recognized that during the in vitro differentiation of embryonic stem cells (ES) into embryoid bodies (EB), genes are expressed in a controlled manner in space and time, reproducing what happens in the embryo in vivo (Leahy et al., 1999). The modified EST is based on the analysis of the possible temporal modification in the expression of markers of differentiation, caused by a specific substance.
The test consists of a screening platform using Multiplex Real-Time PCR that allows the evaluation in EBs, either exposed or not to potentially toxic substances, of the differential expression of a selected genes panel, that are expressed in a time-controlled manner during the differentiation. The analysis includes the study of the expression of genes commonly used as early markers for the specification of the three germ layers and of genes identifying the differentiation of the various cell lines. As marker genes of the three germ layers, oct-3 and Fgf-5 (ectodermic markers; Haub and Goldfarb, 1991), GATA-4 (primer endoderm marker and endodermic tissues markers; Arceci et al., 1993), nodal (which, in the embryo, marks the primitive streak; Zhou et al., 1993), and Brachyury T (early mesoderm marker; Herrmann, 1991) are analyzed. As markers of the various lines, flk-1, as markers of endothelial cells and their precursors (Yamaguchi et al., 1993), Nkx-2.5, cardiogenic mesoderm marker (Lints et al., 1993), EKLF, erythroid line marker (Southwood et al., 1996), and Msx3, which marks the neural tube (Wang et al., 1996) will be analyzed. Comparison of gene expression analysis during the EBs differentiation (from day 3 to day 15) in the study, either in presence or not of a substance, allows to understand whether this can disrupt normal embryonic development.
Examination of Embryotoxicity by Embryotoxicity Assay (ETA)
This test, based on the in vitro culture of pre-implant embryos (blastocysts) of the mouse, evaluates the ability of a substance to interfere with the normal blastocyst release process from the pellucid region (shedding), the subsequent adhesion to the culture plate and the outgrowth. The test was originally developed to evaluate the presence of embryotoxins in the serum of patients affected by recurrent miscarriages, and was subsequently used in a wider toxicological range. Blastocysts are harvested, after hormonal stimulation, from animals at 3.5 days into the pregnancy, are randomly divided into groups of at least 20 and cultured in the presence of the substances which are being studied. The cultures are checked and photographed at regular intervals for the next 72 hours. In our laboratory, this test has been applied to the screening of embryotoxic potential of engineered nanoparticles, in combination with EST.
Rat embryo culture test
The post-implant rat embryo test was developed to identify substances inducing malformations and consequent embryotoxicity; Given its complexity, this test cannot be used as a large-scale screening method, but rather as a secondary approach to a limited number of substances identified as potentially toxic through other tests, to assess the priority for in vivo studies. The test is based on the use of rat embryos at a level of 1-5 somites, which are maintained in rotating cultures for 48 hours, during which the major organogenic events occur (e.g. neural tube closure, eye and ear development). At the end of the growth, the comparison between the controls and embryos cultivated in the presence of the substances being studied allows to point out any alterations in the development.