Laboratorio di Tossicologia Ambientale ed Occupazionale
Il laboratorio di Tossicologia Ambientale e Occupazionale nasce circa sette anni fa dalla attiva collaborazione tra la Sezione di Istologia ed Embriologia e la Sezione di Medicina del Lavoro del Dipartimento di Biomedicina e Prevenzione. Il laboratorio offre una serie di test in vitro, validati dallo European Committee for the Validation of Alternative Methods (ECVAM), per la determinazione del potenziale tossico di sostanze di diversa natura e di materiale particolato, incluse le nanoparticelle ingegnerizzate. L’intenso lavoro di ricerca che caratterizza il laboratorio è indirizzato allo sviluppo e al perfezionamento dei test tossicologici attualmente disponibili. Per questo, il nostro personale altamente qualificato è dedicato allo sviluppo di ulteriori test per un “high-throughput screening” di sostanze potenzialmente embriotossiche.
Il vantaggio dei test di tossicologia dello sviluppo risiede nella loro elevata sensibilità. Le cellule embrionali sono infatti più sensibili a sostanze xenobiotiche rispetto a cellule adulte, permettendo quindi una più sensibile valutazione del potenziale tossico di una specifica sostanza rispetto a test su cellule differenziate.
Il laboratorio dispone di tutte le strumentazioni necessarie e si avvale di personale altamente specializzato con anni di esperienza in questo ambito. Le competenze fino ad oggi acquisite hanno permesso la partecipazione del laboratorio a diversi progetti europei del settimo programma quadro (EU-FP7), incluso il progetto NANoREG (A common European approach to the regulatory testing of Manufactured Nanomaterials), che ha avuto lo scopo di fornire informazioni sull’impatto biologico dei nanomateriali a fini regolatori.
L’offerta dei servizi del Laboratorio di Tossicologia Ambientale e Occupazionale comprende:
Embryonic Stem Cell Test
L’Embryonic stem cell test (EST) è un test validato dall’ECVAM e normalmente utilizzato in campo farmaceutico e industriale per predire il potenziale embriotossico di sostanza chimiche. Sebbene sia stato recentemente riconosciuto che da solo non può essere utilizzato a fini regolatori, questo test permette lo screening preliminare di un ampio numero di sostanze, permettendo l’identificazione di quelle che necessitano di un ulteriore approfondimento con altri test in vitro ed in vivo. L’EST si basa sulla determinazione dei più importanti parametri embriotossici: l'inibizione del differenziamento cellulare si combina con lo studio della differente sensibilità tra i tessuti embrionali e adulti al danno citotossico . In particolare, l’EST utilizza due linee cellulari , le cellule staminali embrionali murine (mES a rappresentare tessuto embrionale ) e le cellule 3T3 (fibroblasti di topo a rappresentare il tessuto adulto ), e valuta tre endpoint: l'inibizione del differenziamento delle mES in corpi embrioidi (strutture che grossolanamente ricapitolano lo sviluppo embrionale in vitro), e l'inibizione della proliferazione delle mES e delle cellule 3T3. I valori numerici ottenuti da questi esperimenti vengono successivamente combinati in un algoritmo che determina il grado di embriotossicità (forte, debole e non embriotossico ). Risultati completi circa il potenziale embriotossico di una particolare sostanza possono essere ottenuti in circa 15-30 giorni.
L’EST è stato recentemente messo a punto e impiegato con successo per la valutazione dell’embriotossicità di particelle con diametro inferiori a 0,1 micron (Pietroiusti et al., 2011; Campagnolo et al., 2013; Farcal et al., 2015;).
Embryonic Stem Cell Test modificato
E’ stato riconosciuto che nel corso del differenziamento in vitro delle cellule embrionali staminali (ES) in corpi embrioidi (EB), vengono espressi geni in maniera regolata, nello spazio e nel tempo, ricapitolando quanto accade nell’embrione in vivo (Leahy et al., 1999). L’EST modificato si basa sulla analisi della possibile modificazione temporale nella espressione di marcatori del differenziamento, causata da una specifica sostanza.
Il test consta di una piattaforma di screening mediante Multiplex Real-Time PCR che permette di valutare in EB esposti o meno a sostanze potenzialmente tossiche l’espressione differenziale di un pannello selezionato di geni, che vengono espressi in maniera temporalmente regolata nel corso del differenziamento. L’analisi comprende lo studio dell’espressione di geni che vengono comunemente utilizzati come marcatori precoci della specificazione dei tre foglietti embrionali e di geni che identificano il differenziamento delle varie linee cellulari. Come geni marcatori dei tre foglietti embrionali vengono analizzati oct-3 e Fgf-5 (marcatori di ectoderma; Haub and Goldfarb, 1991), GATA-4 (marcatore di endoderma primitivo e di tessuti di derivazione endodermica; Arceci et al., 1993), nodal (che nell’embrione marca la stria primitiva; Zhou et al., 1993), e Brachyury T (marcatore precoce di mesoderma; Herrmann, 1991). Come marcatori delle varie linee verranno analizzati flk-1, quale marcatore delle cellule endoteliali e dei loro precursori (Yamaguchi et al., 1993), Nkx-2.5, marcatore del mesoderma cardiogenico (Lints et al., 1993), EKLF, marcatore della linea eritroide (Southwood et al., 1996), e Msx3, che marca il tubo neurale (Wang et al., 1996). Il confronto dell’analisi di espressione genica nel corso del differenziamento degli EB (dal giorno 3 al giorno 15), in presenza o meno di una sostanza in studio permette di capire se questa è in grado di perturbare il normale sviluppo embrionale.
Analisi dell’Embriotossicità mediante Embryotoxicity Assay (ETA)
Questo test, basato sulla coltura in vitro di embrioni pre-impianto (blastocisti) di topo, valuta la capacità di una sostanza di interferire con il normale processo di uscita delle blastocisti dalla zona pellucida (sgusciamento), la successiva adesione alla piastra di coltura e l’apertura (outgrowth). Il test è stato originariamente sviluppato per valutare la presenza di embrio-tossine nel siero di pazienti affette da aborti ricorrenti, ed è stato successivamente impiegato in un più vasto ambito tossicologico. Le blastocisti vengono raccolte, dopo stimolazione ormonale, da animali al girono 3.5 di gravidanza, vengono casualmente divise in gruppi di almeno 20 e messe in coltura in presenza di delle sostanze in esame. Le colture sono controllate e fotografate ad intervalli regolari per le successive 72 ore. Nel nostro laboratorio questo test è stato applicato allo screening del potenziale embriotossico delle nanoparticelle ingegnerizzate, in combinazione con l’EST.
Test dell’Embrione di ratto in coltura
Il test dell’embrione post-impianto di ratto è stato sviluppato per identificare sostanze che inducono malformazioni e conseguente embriotossicità; data la sua complessità, questo test non può essere impiegato come un metodo di screening su larga scala, ma piuttosto come un approccio secondario per un limitato numero di sostanze identificate come potenzialmente tossiche mediante altri test, per stabilirne la priorità per studi in vivo. Il test si basa sull’uso di embrioni di ratto allo stadio di 1-5 somiti, che vengono mantenuti in colture rotanti per 48 ore, periodo durante il quale avvengono i principali eventi dell’organogenesi (e.g., chiusura del tubo neurale, sviluppo dell’occhio e dell’orecchio). Al termine della coltura il confronto tra controlli ed embrioni coltivati in presenza delle sostanze in esame permette di evidenziare eventuali alterazioni dello sviluppo.
Il vantaggio dei test di tossicologia dello sviluppo risiede nella loro elevata sensibilità. Le cellule embrionali sono infatti più sensibili a sostanze xenobiotiche rispetto a cellule adulte, permettendo quindi una più sensibile valutazione del potenziale tossico di una specifica sostanza rispetto a test su cellule differenziate.
Il laboratorio dispone di tutte le strumentazioni necessarie e si avvale di personale altamente specializzato con anni di esperienza in questo ambito. Le competenze fino ad oggi acquisite hanno permesso la partecipazione del laboratorio a diversi progetti europei del settimo programma quadro (EU-FP7), incluso il progetto NANoREG (A common European approach to the regulatory testing of Manufactured Nanomaterials), che ha avuto lo scopo di fornire informazioni sull’impatto biologico dei nanomateriali a fini regolatori.
L’offerta dei servizi del Laboratorio di Tossicologia Ambientale e Occupazionale comprende:
Embryonic Stem Cell Test
L’Embryonic stem cell test (EST) è un test validato dall’ECVAM e normalmente utilizzato in campo farmaceutico e industriale per predire il potenziale embriotossico di sostanza chimiche. Sebbene sia stato recentemente riconosciuto che da solo non può essere utilizzato a fini regolatori, questo test permette lo screening preliminare di un ampio numero di sostanze, permettendo l’identificazione di quelle che necessitano di un ulteriore approfondimento con altri test in vitro ed in vivo. L’EST si basa sulla determinazione dei più importanti parametri embriotossici: l'inibizione del differenziamento cellulare si combina con lo studio della differente sensibilità tra i tessuti embrionali e adulti al danno citotossico . In particolare, l’EST utilizza due linee cellulari , le cellule staminali embrionali murine (mES a rappresentare tessuto embrionale ) e le cellule 3T3 (fibroblasti di topo a rappresentare il tessuto adulto ), e valuta tre endpoint: l'inibizione del differenziamento delle mES in corpi embrioidi (strutture che grossolanamente ricapitolano lo sviluppo embrionale in vitro), e l'inibizione della proliferazione delle mES e delle cellule 3T3. I valori numerici ottenuti da questi esperimenti vengono successivamente combinati in un algoritmo che determina il grado di embriotossicità (forte, debole e non embriotossico ). Risultati completi circa il potenziale embriotossico di una particolare sostanza possono essere ottenuti in circa 15-30 giorni.
L’EST è stato recentemente messo a punto e impiegato con successo per la valutazione dell’embriotossicità di particelle con diametro inferiori a 0,1 micron (Pietroiusti et al., 2011; Campagnolo et al., 2013; Farcal et al., 2015;).
Embryonic Stem Cell Test modificato
E’ stato riconosciuto che nel corso del differenziamento in vitro delle cellule embrionali staminali (ES) in corpi embrioidi (EB), vengono espressi geni in maniera regolata, nello spazio e nel tempo, ricapitolando quanto accade nell’embrione in vivo (Leahy et al., 1999). L’EST modificato si basa sulla analisi della possibile modificazione temporale nella espressione di marcatori del differenziamento, causata da una specifica sostanza.
Il test consta di una piattaforma di screening mediante Multiplex Real-Time PCR che permette di valutare in EB esposti o meno a sostanze potenzialmente tossiche l’espressione differenziale di un pannello selezionato di geni, che vengono espressi in maniera temporalmente regolata nel corso del differenziamento. L’analisi comprende lo studio dell’espressione di geni che vengono comunemente utilizzati come marcatori precoci della specificazione dei tre foglietti embrionali e di geni che identificano il differenziamento delle varie linee cellulari. Come geni marcatori dei tre foglietti embrionali vengono analizzati oct-3 e Fgf-5 (marcatori di ectoderma; Haub and Goldfarb, 1991), GATA-4 (marcatore di endoderma primitivo e di tessuti di derivazione endodermica; Arceci et al., 1993), nodal (che nell’embrione marca la stria primitiva; Zhou et al., 1993), e Brachyury T (marcatore precoce di mesoderma; Herrmann, 1991). Come marcatori delle varie linee verranno analizzati flk-1, quale marcatore delle cellule endoteliali e dei loro precursori (Yamaguchi et al., 1993), Nkx-2.5, marcatore del mesoderma cardiogenico (Lints et al., 1993), EKLF, marcatore della linea eritroide (Southwood et al., 1996), e Msx3, che marca il tubo neurale (Wang et al., 1996). Il confronto dell’analisi di espressione genica nel corso del differenziamento degli EB (dal giorno 3 al giorno 15), in presenza o meno di una sostanza in studio permette di capire se questa è in grado di perturbare il normale sviluppo embrionale.
Analisi dell’Embriotossicità mediante Embryotoxicity Assay (ETA)
Questo test, basato sulla coltura in vitro di embrioni pre-impianto (blastocisti) di topo, valuta la capacità di una sostanza di interferire con il normale processo di uscita delle blastocisti dalla zona pellucida (sgusciamento), la successiva adesione alla piastra di coltura e l’apertura (outgrowth). Il test è stato originariamente sviluppato per valutare la presenza di embrio-tossine nel siero di pazienti affette da aborti ricorrenti, ed è stato successivamente impiegato in un più vasto ambito tossicologico. Le blastocisti vengono raccolte, dopo stimolazione ormonale, da animali al girono 3.5 di gravidanza, vengono casualmente divise in gruppi di almeno 20 e messe in coltura in presenza di delle sostanze in esame. Le colture sono controllate e fotografate ad intervalli regolari per le successive 72 ore. Nel nostro laboratorio questo test è stato applicato allo screening del potenziale embriotossico delle nanoparticelle ingegnerizzate, in combinazione con l’EST.
Test dell’Embrione di ratto in coltura
Il test dell’embrione post-impianto di ratto è stato sviluppato per identificare sostanze che inducono malformazioni e conseguente embriotossicità; data la sua complessità, questo test non può essere impiegato come un metodo di screening su larga scala, ma piuttosto come un approccio secondario per un limitato numero di sostanze identificate come potenzialmente tossiche mediante altri test, per stabilirne la priorità per studi in vivo. Il test si basa sull’uso di embrioni di ratto allo stadio di 1-5 somiti, che vengono mantenuti in colture rotanti per 48 ore, periodo durante il quale avvengono i principali eventi dell’organogenesi (e.g., chiusura del tubo neurale, sviluppo dell’occhio e dell’orecchio). Al termine della coltura il confronto tra controlli ed embrioni coltivati in presenza delle sostanze in esame permette di evidenziare eventuali alterazioni dello sviluppo.